Super-Enhancer-Driven SOX4/SMAD3 Mediate Membrane Remodeling by Regulating Phospholipid Metabolism to Accelerate Leukemia Progression

《Advanced Science》（IF=14.1）

摘要

慢性髓系白血病（CML）由 BCR -ABL融合癌基因驱动，病程从慢性期（CP）进展至急变期（BP）。

虽然酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）能有效控制CML-CP，但CML-BP仍是一个治疗难题，其特征是治疗耐药性和生存率低下。

越来越多的证据表明，表观遗传调控元件的异常激活会重塑癌症中的转录组，导致对特定转录调节因子产生依赖性，从而推动癌症进展。

然而，具体哪些转录机制促进了CML-CP向CML-BP的转变尚不明确。本研究在CML-BP中鉴定出由超级增强子驱动的转录因子SOX4和SMAD3。

SOX4与SMAD3通过分别结合各自的超级增强子和启动子，形成正反馈轴。功能实验证实该轴在体外和体内均能促进白血病进展。

从机制上看，SOX4/SMAD3结合于受体酪氨酸激酶 AXL 的启动子和增强子区域，增强其转录活性，进而激活 AKT /ERK/STAT5信号通路；同时，它们通过转录上调LPCAT1基因表达，后者可重塑膜磷脂结构以促进 AXL 的定位。

值得注意的是， AXL 抑制剂贝森替尼在体内外模型中均能有效抑制CML-BP的进展。

总体而言，我们的研究结果确立了SE驱动的SOX4和SMAD3作为CML-BP的关键调控因子，并将贝森替尼确定为一种前景广阔的治疗策略。

一、研究背景与科学问题

1.CML疾病特点

由t(9;22)易位产生BCR-ABL融合癌基因驱动，分三期：慢性期（CP，原始细胞<10%）、加速期（AP）、急变期（BP，原始细胞≥20%）。

急变后呈急性白血病表型，TKIs（伊马替尼等）普遍耐药，生存期极短，是临床未满足需求。

2.表观遗传与超级增强子（SE）

SE是高密度增强子簇，高H3K27ac修饰，驱动癌基因高表达，决定肿瘤身份与进展。SE在肉瘤、淋巴瘤、神经母细胞瘤中已被证实，但在CML急变中的驱动机制完全未知。

3. 核心科学问题

CML急变是否存在SE驱动的关键转录因子？

其如何通过非BCR-ABL依赖通路推动急变？

能否找到可靶向的关键节点用于治疗？

二、研究策略与技术路线

1.临床队列：

40例CML（19例CP，21例BP）原代样本。

2.组学技术

◦H3K27ac ChIP-seq（鉴定SE）

◦RNA-seq（表达谱）

◦CUT&Tag（SOX4/SMAD3全基因组结合）

◦脂质组学（磷脂代谢）

3C（染色质环）、ChIP-re-ChIP、双荧光素酶、Co-IP等。

3.细胞模型：

K562、LAMA-84、KBM5、KU812、KBM5-T315I（耐药株）。

4.动物模型

◦BA模型：BCR-ABL单驱动

◦BA/NH模型：BCR-ABL+NUP98-HOXA9共驱动（更接近人急变）

5.干预手段：

shRNA敲低、过表达、dCas9-KRAB沉默增强子、药物抑制剂。

三、结果

3.1 鉴定CML急变期SE驱动的SOX4/SMAD3正反馈轴

1.筛选SE驱动转录因子

•对比CP与BP的H3K27ac ChIP-seq，鉴定24个BP特异性SE。

• 结合RNA-seq，筛选出4个显著上调的SE驱动转录因子：SOX4、SMAD3、CXXC5、KLF9。

• IGV显示：BP样本在SOX4、SMAD3基因座的SE区域H3K27ac信号显著高于CP。

2. SOX4与SMAD3呈急变期特异性正相关• TCGA与本队列表达数据：仅在CML-BP强正相关，CP与AML中无此相关性。

• 细胞水平验证：◦ 敲低SOX4 → SMAD3表达下降；敲低SMAD3 → SOX4表达下降。◦ 过表达SOX4 → SMAD3上升；过表达SMAD3 → SOX4上升。

• BET抑制剂（ABBV-744、ARV-771）可剂量依赖性抑制两者，证明依赖SE活性。

3. 相互调控的分子基础

• 基序分析：SOX4与SMAD3的SE区均含对方结合基序。 

• CUT&Tag + ChIP-re-ChIP：两者共结合在彼此的启动子与SE区。

• 蛋白互作（Co-IP）：SOX4与SMAD3直接结合。

• 3C实验：SOX4的增强子CE2与启动子形成染色质环，空间上促进转录。

• dCas9-KRAB沉默CE2：H3K27ac下降、两者结合减少、表达下降、细胞增殖受抑、分化恢复。

结论：SOX4/SMAD3形成SE驱动的自我激活+相互激活正反馈环路，是CML急变的核心转录调控模块。

3.2 SOX4/SMAD3协同重塑转录组驱动急变1. 全基因组协同结合特征

• 两者更倾向共结合（dual-binding），而非单独结合。

• 共结合区域：H3K27ac更高、更富集SE、靶基因表达更高。

• 约40%共结合区域中，两者结合位点间距<146 bp（核小体跨度），保证高效协同。

2. 敲低后转录组变化

• 敲低SOX4或SMAD3，差异基因高度重叠。• GSEA显示：共同下调基因显著富集于CML急变期特征基因集。

• 共同上调基因富集于分化相关通路。

结论：SOX4/SMAD3以高度协同方式构建急变特异性转录程序。

3.3 SOX4/SMAD3功能上驱动CML恶性进展（体外）

1.增殖与集落形成

• 单敲低SOX4/SMAD3：细胞增殖减慢、集落数量减少40%–60%、体积变小。

• 过表达：增殖显著增强。

• 双敲低：抑制效果显著强于单敲低，呈协同效应。

2. 细胞分化

• 敲低：促进红系（CD71）、巨核系（CD61）、粒系（CD11b）分化。

• 过表达：抑制分化，维持“未成熟急变表型”。

3. 回补实验

• 敲低SOX4 → 过表达SMAD3可部分恢复恶性表型。

• 敲低SMAD3 → 过表达SOX4可部分恢复恶性表型。

结论：SOX4/SMAD3是CML急变的必需因子，协同促进增殖、抑制分化、驱动急变。

3.4 下游通路——AXL是非BCR-ABL依赖的关键效应激酶

1.通路富集

• 共同下调基因富集：受体酪氨酸激酶（RTK）信号、脂质代谢。

• 排除BCR-ABL：敲低SOX4/SMAD3不改变BCR-ABL表达与磷酸化。

2. 锁定AXL

• 多个RTK中，仅AXL被两者共同调控。• SOX4/SMAD3直接结合AXL启动子与增强子，转录激活AXL。

3. AXL功能验证

• 敲低AXL：抑制增殖、促进分化，与SOX4/SMAD3敲低表型一致。

• AXL抑制剂Bemcentinib：有效杀伤CML-BP细胞，包括T315I耐药株。

• 信号机制：AXL激活p-AKT、p-ERK、p-STAT5，构成致癌信号轴。

4. 配体GAS6作用

• 内源性GAS6不受SOX4/SMAD3/AXL影响。• 外源性GAS6仅微弱回补表型，提示AXL膜定位比配体更关键。

结论：SOX4/SMAD3通过AXL激活非BCR-ABL依赖的致癌信号。

3.5 膜代谢机制——LPCAT1重塑磷脂决定AXL膜定位与活性

 1.脂质组学发现

• 敲低SOX4/SMAD3：饱和磷脂（SFA-PL）显著下降，多不饱和磷脂（PUFA-PL）上升。

• 关键分子：DPPC（16:0/16:0） 下降最显著。

2. 膜流动性与AXL定位

• FRAP实验：敲低后膜流动性升高。

• 免疫荧光：AXL从细胞膜转位到胞内，失去活性。

3. 关键酶LPCAT1

• SOX4/SMAD3直接结合LPCAT1启动子与增强子，转录激活。

• LPCAT1是磷脂重塑（Lands循环）关键酶，负责合成饱和磷脂酰胆碱（PC）。

• 敲低LPCAT1：

◦ 饱和磷脂下降、膜流动性上升◦ AXL内吞、信号失活

◦ 增殖受抑、分化恢复

• 回补实验：

◦ 过表达LPCAT1 → 恢复膜流动性、AXL膜定位、增殖能力

◦ 外源添加DPPC → 同样可回补表型

4. 双机制协同

• SOX4/SMAD3对CML进展的驱动依赖两条通路缺一不可：

1.直接转录上调AXL

2. 通过LPCAT1-饱和磷脂重塑膜，保证AXL定位与活化

• 仅回补AXL / 仅回补LPCAT1 / 仅加DPPC，均不能完全逆转；三者联合才可完全恢复。

结论：SOX4/SMAD3-LPCAT1-饱和磷脂轴通过膜重塑控制AXL功能，是此前未被发现的“代谢-信号”耦联机制。

3.6 体内验证——靶向该轴可抑制CML急变并延长生存

1.敲低SOX4/SMAD3的治疗效果

• 外周血：GFP+白血病细胞减少、白细胞总数下降。

• 骨髓：白血病细胞植入降低、原始细胞比例下降、分化恢复。

• 脾脏：脾肿大减轻、白血病浸润减少。

• 生存：显著延长小鼠生存期。

• 分子验证：体内同样下调AXL、LPCAT1，磷脂饱和度下降。

2. AXL抑制剂Bemcentinib治疗效果

• 给药方式：25 mg/kg，每日两次灌胃。

• 疗效：降低白血病负荷、改善血象、减轻脾肿大、延长生存。

• 安全性：体重无明显下降，肝肾功能（ALT/AST/CR）无异常。

• 信号：显著抑制p-AXL、p-STAT5、p-AKT、p-ERK。

3. 联合用药潜力

• Bemcentinib与伊马替尼具有强协同作用，提示可克服TKIs耐药。

四、结论

1.CML急变期出现超级增强子激活，驱动SOX4与SMAD3高表达。

2. SOX4与SMAD3形成正反馈环路，稳定维持高表达。

3. 双重机制驱动急变：

◦转录轴：直接激活AXL，启动AKT/ERK/STAT5致癌信号。

◦ 代谢轴：激活LPCAT1，提高饱和磷脂水平，降低膜流动性，保证AXL定位于细胞膜并充分活化。

4. AXL抑制剂Bemcentinib可有效阻断该轴，抑制CML急变，是潜在临床药物。

5. 该研究首次建立：SE→转录因子→磷脂代谢→膜受体定位→致癌信号的完整链条，为白血病急变机制提供全新范式。

五、创新点与临床价值

1.首次报道SE驱动的SOX4/SMAD3是CML急变的核心转录因子。

2. 首次揭示LPCAT1-饱和磷脂-膜流动性调控RTK定位的代谢-信号耦联机制。

3. 首次证实AXL抑制剂Bemcentinib对CML急变有效，可克服耐药。

4. 为CML急变提供3个可靶向节点：SOX4/SMAD3、LPCAT1、AXL。

六、总论

本研究揭示了一个由SOX4/SMAD3协同作用驱动的特异性转录调控网络：SOX4与SMAD3不仅直接调控 AXL 的表达，还通过调节LPCAT1介导的膜磷脂重塑影响其膜定位与激活——这两项机制在慢性髓系白血病（CML）进展中均起关键作用。这些发现深化了我们对CML转化过程中转录失调机制的理解，并为潜在治疗策略提供了依据。

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